密度梯度離心技術(shù)分離穩(wěn)定同位素的方法
導(dǎo)讀:有別于傳統(tǒng)的通過富集分離純化技術(shù)獲得一些純培養(yǎng)污染物降解功能微生物，穩(wěn)定同位素技術(shù)（SIP-DNA）可以更加便捷的鑒定出功能基因。本研究上海安亭科學(xué)儀器廠針對 SIP-DNA 中密度梯
來源：未知
發(fā)布日期：2020-01-09 11:45【大 中 小】
據(jù)上海安亭科學(xué)儀器廠了解到超速離心機是分子生物實驗室最常用的科研儀器之一，能將具有不同沉降系數(shù)、質(zhì)量和密度的混合物在離心機高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力場作用下進(jìn)行快速分離、濃縮和純化。密度梯度區(qū)帶離心法(簡稱區(qū)帶離心法)，是超速離心機常用的一種離心方法，在一定的離心力下將加入惰性梯度介質(zhì)的樣品進(jìn)行離心沉降，把所需的顆粒分配到梯度中某些特定位置，形成不同區(qū)帶的分離方法。該法能夠在保持顆粒活性條件下很好地將不同顆粒的物質(zhì)進(jìn)行分離。上海安亭科學(xué)儀器廠為探究環(huán)境中降解某種污染物功能微生物，傳統(tǒng)的方法是通過加大富集培養(yǎng)和分離的方式獲得。然而，并非所有微生物都可以獲得純培養(yǎng)，而且實驗室條件下獲得可培養(yǎng)的土壤微生物受到很多因素的限制。所以通過傳統(tǒng)方式獲得的某種污染物的功能降解菌可能無法準(zhǔn)確反映污染環(huán)境中微生物分布的真實情況，也不能預(yù)測功能微生物對底物的同化代謝水平。
本研究上海安亭科學(xué)儀器廠就從這些問題出發(fā)，采用密度梯度離心法中的等密度區(qū)帶離心法，以貝克曼公司的OptimaXPN-100超速離心機，VTI-90垂直轉(zhuǎn)頭為例，用氯化銫為介質(zhì)，構(gòu)建了超速離心機分離SIP-DNA樣品的條件、相關(guān)參數(shù)，以及如何根據(jù)離心后樣品的指標(biāo)判定樣品是否有效分離。目前該技術(shù)在國內(nèi)只有少數(shù)幾個團隊使用，掌握該技術(shù)，可以為高校科研和教學(xué)提供強有力的技術(shù)手段，而且大大提高昂貴的超速離心機的使用價值。
FastDNA快速提取試劑盒（MoBioLaboratories,SolanaBeach,CA），CsCl（AR99%，成都西亞試劑），Tris-EDTA（TE，pH8.0）。OptimaXPN-100超速離心機，貝克曼垂直轉(zhuǎn)子VTI-90（最高轉(zhuǎn)速(rpm)90000，最大相對離心力(×g)645000，最大容量(ml)8×5.1），ND-1000UV-vis紫外可見分光光度計（NanoDropTechnologies，Wilmington，DE），AR200數(shù)顯手持式折光儀（LeicaMicrosystemsInc.）。
密度梯度離心技術(shù)是實現(xiàn)SIP-DNA樣品分離的關(guān)鍵技術(shù)，本研究上海安亭科學(xué)儀器廠通過實驗獲得了超速離心機分離SIP-DNA樣品的最佳條件（以CsCl為惰性介質(zhì)，在20℃，45000g離心48小時，離心后分為14層）。根據(jù)每層的浮力密度和DNA濃度這兩個參數(shù)可以判定分離是否成功，成功分離后的重的同位素樣品與正常樣品相比不僅相同層數(shù)浮力密度大，在相同浮力密度層DNA濃度最大位置也會比較靠后。該技術(shù)可為后續(xù)16SrRNA高通量測序提供前提和保障。根據(jù)高通量數(shù)據(jù)結(jié)果可以從整體水平上反應(yīng)環(huán)境樣品微生物群落水平，也可以更準(zhǔn)確的認(rèn)識自然條件下微生物的作用與具體的功能微生物。
以上內(nèi)容僅供參考。
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